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【新手必看】为什么某线路一测序总有突变?

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发表于 2018-9-4 23:47:20 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 CCiCer 于 2018-9-5 19:08 编辑

iGEM新手刚刚开始接触分子实验,往往会因为一些常见问题困扰不已,今天要提到的就是一类十分常见的情况及解决对策。

你是否有遇到过这类情况:

1、我做分子克隆过去做都好好的,突然有某个或某组线路连接不出来了,排除试剂和技术操作问题还是连不起来。

2、某个或某组线路连接以后做转化,菌落明显比类似条件(如长度)的线路正常情况下较少

3、某个或某组线路连接以后转化,colony PCR发现阳性率异常低,长度大部分不对

4、某个或某组线路连接以后转化,colony PCR通过,连续测序好几个都有影响功能的突变

5、敲除某个基因,怎么敲也敲不掉,敲入某个基因,怎么敲也敲不进去

……

以上情形越是平时“手艺好”的同学,遇到的时候越要注意了。因为这背后有时藏着一类很容易被初学者忽略的问题:线路的毒性和生理负担。

当初学者设计一条基因线路的时候,往往把注意力放在其功能上,而常常没有注意到线路当中基因的表达量是否合适,线路中包含的一些异源基因或工程化改造的蛋白的编码基因,其表达产物是否有毒性或对细胞造成负担的问题——进而默认这个线路是可以存在于细胞当中的。

而然现实并非如此,网络上关注军事话题的朋友常常挂在嘴边一句话,叫“只要推力大,板砖能上天”。

同样的,“只要表达量够高,荧光蛋白杀细胞”

这句话当然是夸张的说法,但也不是完全错误,当表达量过高的情况下,即使是看起来人畜无害的GFP基因,也会在表达过程中占用大量转录翻译资源,还会在细菌细胞中形成包涵体,显著抑制细胞的正常生长分裂。

实际上,外源基因或一些经过改造的蛋白质的基因,在大肠杆菌中表达的时候,对细胞的正常生长造成不同程度的干扰甚至毒性是非常常见的现象。比如CRISPR系统的Cas9、dCas9,在包括大肠杆菌在内的多种原核生物中都需要把表达量控制在低水平,稍微过高就会严重抑制细胞生长分裂。

这些线路在克隆的过程中,如果使用了强度过高的组成型启动子,再搭配上高拷贝的载体,很有可能在分子克隆过程中无法、或者很难被克隆出来。最直接的表现就是连接产物转化得不到阳性菌落,或colony PCR看似长度正确,一旦测序却发现都是突变。原因很简单,那些“正确”的线路也许可以完成DNA连接,但转化以后,要么菌落根本无法生长出来,要么生长极其缓慢。24小时肉眼可见的菌落都是阴性,阳性菌落有时即使可以勉强生长,也需要更长培养时间可能看见。

知道了这个原理,在回头看看上面我们列出的几种情况,就很好理解了。
有的队伍前面连接都很好,偏偏最后一步连接启动子,怎么也连不上去——往往就是这种原因,没有启动子的线路还没有表达任何表达产物,对细胞尚未呈现出毒性和负担,但是一旦连了启动子,情况就不一样了。这种时候如果一味重复做连接,反而耽误和浪费了大量时间。

那么遇到这种情况怎么办呢?——首先,当然还是要排除其它问题,不能一遇到做不出来就怀疑是毒性,也有可能确实是分子克隆技术还不过关,但是如果操作和实验技术本身的因素都排除了,失败的规律也指向可能是线路毒性问题,那么原来的线路设计肯定就不能用了。
从设计上而言:
1)在没有参考文献支持的情况下,善用诱导型启动子
组成型启动子固然序列短小,不需要诱导物即可表达,受到许多iGEMer的追捧,但实际上对于从未在细胞中实验过的新元件、新基因(外源或工程化改造的),诱导型启动子才是最安全的选择,且泄漏表达越低的越好。
确保线路在没有诱导物的状态下大部分不必要开启的基因处于off的状态。
2)善用低拷贝载体
合成生物学研究中,低拷贝载体出现的频率甚至高于高拷贝载体。许多基因在自然状态下(来源基因组中),本来拷贝数就极低,低拷贝载体在拷贝数上更接近其天然状态,有利于保留和呈现其功能。
3)多查阅文献
iGEMer使用的基因往往都有一定的参考文献可供查询,这些参考文献所提及的毒性问题(如果有研究过的话),所使用的菌株、启动子、载体、诱导物剂量都是非常重要的线索,有助于规避上述问题。
从实验上来说:
1)如果对毒性问题不确定,克隆步骤上,最后一步同时插入到高、低拷贝数两种载体上
2)循序渐进,对复合线路中独立的转录单位进行独立的测试,测定其对细胞毒性和负担
3)诱导物浓度要做优化实验

以上都是一些经验随笔,希望对新一年的iGEMer有所帮助。

当然回到帖子的标题:为什么我做的线路一测序常常有突变?
除了我们今天探讨的一类原因——也有可能:
你用了Taq做PCR
你们订购引物的公司产品质量不好
Gibson有一定的概率在接口区域造成突变

分子实验的TS往往是非常有“特异性”的,大家不要生搬硬套,记住:

唯一能够解决实验上问题的,只有更多的实验。

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